分子生物學(xué)中,分子克隆是最常用的方法之一。適合序列的基因可以插入質(zhì)體中并與載體連接,接著該質(zhì)體轉(zhuǎn)移到大腸桿菌的細(xì)胞中。
乳糖操縱子是一個(gè)在大腸桿菌及其他腸道菌科細(xì)菌內(nèi)負(fù)責(zé)乳糖的運(yùn)輸及代謝的操縱子。它包含了三個(gè)相連的結(jié)構(gòu)基因,啟動(dòng)子、終止子及操縱基因。乳糖操縱子受多種因素所調(diào)控,包括葡萄糖及乳糖的含量。乳糖操縱子的基因調(diào)節(jié)是 首個(gè)被闡明的遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制,且被視作為原核生物基因調(diào)節(jié)的樣本。
乳糖操縱子包含三個(gè)結(jié)構(gòu)基因、啟動(dòng)子、終止子及操縱基因。這三個(gè)結(jié)構(gòu)基因稱為lacZ、lacY及l(fā)acA。lacZ編碼β-半乳糖苷酶,這是一種將雙糖乳糖水解為葡萄糖與半乳糖兩個(gè)單糖的酶。lacY編碼β-半乳糖苷透性酶,這是一種在細(xì)胞膜的運(yùn)送蛋白質(zhì),負(fù)責(zé)將乳糖逼入細(xì)胞中。lacA編碼β-半乳糖苷乙?;D(zhuǎn)移酶,這是一種酶將乙酰基從乙醘輔酶A轉(zhuǎn)移至β-半乳糖苷。當(dāng)中只有l(wèi)acZ及l(fā)acY在乳糖的分解代謝是必須的。
乳糖操縱子基因的獨(dú)特控制受細(xì)菌乳糖底物的存在影響。當(dāng)乳糖不作為唯一碳源存在時(shí),細(xì)菌就不會產(chǎn)生蛋白質(zhì)。乳糖操縱子基因會組成操縱子:它們會在染色體附近被導(dǎo)向成同一方向,并會一并轉(zhuǎn)錄成單一多基因性的mRNA分子。所有基因的轉(zhuǎn)錄會由RNA聚合酶(一個(gè)DNA結(jié)合蛋白)與一個(gè)位于基因上游獨(dú)特的DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合開始,這個(gè)位點(diǎn)稱為啟動(dòng)子。由這個(gè)位點(diǎn)開始,RNA聚合酶會開始轉(zhuǎn)錄所有三個(gè)基因(lacZYA)為mRNA。
對乳糖的調(diào)控反應(yīng)需要一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)蛋白,稱為乳糖阻遏物。lacI基因會為位于乳糖操縱子附近的阻遏基因編碼,并且會表現(xiàn)出來。如果在生長環(huán)境中缺乏乳糖,阻遏物會緊密地與位于啟動(dòng)子下游接近LacZ的短DNA序列(稱為乳糖操縱基因)結(jié)合。與操縱基因結(jié)合的阻遏物會干擾RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合,所以mRNA可以在很低水平的情況下為LacZ及LacY編碼。當(dāng)細(xì)胞在有乳糖的環(huán)境下成長時(shí),稱為異乳糖的乳糖代謝物會與阻遏物結(jié)合,容許RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄乳糖基因,并從而引發(fā)高水平的編碼蛋白。
一系列的乳糖衍生物或類似物被認(rèn)為協(xié)助乳糖操縱子的工作。這些化合物主要是取代半乳糖苷,當(dāng)中乳糖的葡萄糖部分被其他官能團(tuán)所取代。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(簡稱IPTG)是經(jīng)常在生理學(xué)上被用來作為乳糖操縱子的誘導(dǎo)物。IPTG與阻褐基因結(jié)合并使之不活躍,但卻非β-半乳糖苷酶的基底。IPTG在體內(nèi)研究的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它不能被大腸肝菌所代謝,所以細(xì)胞的生長率在實(shí)驗(yàn)中并非變數(shù)。再者,IPTG能在缺乏lacY基因下而有效地被運(yùn)送。并且,由于細(xì)胞不會代謝IPTG,它的濃度在實(shí)驗(yàn)中并不會改變。
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